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基因工程抗体

基因工程抗体(gene engineering antibody，GEAb)是通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。

基因工程抗体包括三种，即嵌合抗体，改型抗体和全套抗体库(Repenoire library)。前二者属于部分人源化抗体，而全套抗体库属全人源化抗体，目标是实现抗体的人源化、小型化和多功能化，以解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应，其基本片段为Fab，scFv(single-chain variable fragment)单链抗体和Fv(VH-VL)。在单链抗体的基础上又可形成双价抗体、三价抗体、四价抗体等，在免疫学诊断及治疗上有独特的应用。基因工程抗体采用噬菌体抗体库、核糖体展示技术、转基因鼠等技术。噬菌体抗体是应用最为普遍的抗体库技术。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体、筛选全人源性抗体和高亲和性抗体。核糖体展示抗体库技术，筛选抗体的全部过程均在体外进行，不需经过大肠杆菌转化的步骤，因此可以建构高容量、高质量的抗体库，更易于筛选高亲和力抗体和采用体外进化的方法对抗体性质进行改造。用于制备针对不同靶抗原的完全人抗体的转基因鼠的问世，是继噬菌体抗体库技术之后抗体人源化技术的又一重大突破。转基因鼠能识别人体蛋白为异物，而产生针对该蛋白的人抗体。

(一)单链抗体的特性及应用

单链抗体是在DNA水平上将轻、重链可变区基因用一段适当的寡核苷酸链(Linker，接头)连起来，使之在适当的生物体中表达成为一条单一的肽链，称为单链抗体(Single chain Fv，ScFv)。单链抗体具有比完整抗体更大的优越性。只要合成适当的引物便可用PCR方法将重、轻链V区基因扩增出来，插入适当的表达载体，在大肠杆菌等原核细胞表达体系中表达，通过细菌发酵生产，降低了成本；ScFv的分子量小，实体组织穿透力比完整抗体强，但抗原结合活性相同；由于没有Fc片段，不能与非靶细胞的Fc受体结合而容易穿过血管壁或组织屏障进人实体瘤周转的微循环，因此特异性好，有利于对肿瘤等疾病的治疗；单链抗体的N端或C端容易与其他分子如酶、毒素、细胞因子等拼接及单链抗体本身融合。并且表达的重组蛋白既不影响单链抗体的抗原结合能力，也不影响与之融合的蛋白质的生物学特性。

1．肿瘤的体内显像诊断：完整抗体分子在体液中存留时间长，显像时信噪比低，其分子量大，不易穿透组织，因而效果差，在携带毒性物质时毒性较大。ScFv排除速度快，穿透力强，因此在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高。在放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低，因此是较为理想的显像定位诊断载体，为肿瘤的诊断提供了新的途径。 I标记的抗CEA双特异性抗体可以检测直径小于3mm的肿瘤，作为一种肿瘤特异的探针，明显减少对正常组织地损害，可制作出高对比度影像。Goel等用二硫键将ScFv的C末端Gly Cys尾与 结合，构建标记的ScFv，不但具有良好的亲和活性，而且在盐溶液、血浆中稳定，对人卵巢癌显像良好。有报道IFN．^y与”。I标记的ScFv联合应用，可使肿瘤局部标记浓度增高2～4倍，明显增强显像效果。

2．病毒的诊断和抗病毒感染：ScFv制备技术的成功，为医学上某些至今难以治疗的疾病如病毒病的诊断和治疗提供了新的、高效的免疫制剂。对于病毒感染至今无特效药物，因此免疫治疗和诊断显得尤为重要。单链抗体可用于HIV-1和HIV一2病毒的诊断，并可中和HIV病毒，降低患者血清中病毒的效价，有希望成为AIDS有效的治疗药物。抗SARS冠状病毒刺突蛋白s1结构域的ScFv可以中和SARS冠状病毒且可抑制合胞作用，有望用于SARS的诊断及治疗。Rau等认为只要第一次构建单链抗体成功。以后只需一步就能把各种抗体的抗原结合区(VH—VL)插人载体，制备出各种单克隆酶联抗体。

3．血液性疾病的诊断：抗人白血病单链抗体可用于白血病的免疫诊断及分型。然而单链抗体也有一些缺点：如多数单链抗体为单价抗体，与双价抗体相比，它们与靶细胞表面抗原的结合能力弱，因而效能也低；单链抗体的表达也存在一些问题，如表达产生的表达部位、表达量、溶解性等，以包涵体形式的表达量较高，但需在体外正确折叠和复性。

(二)双特异性单克隆抗体(双特异性抗体)的特点及应用

双特异性抗体的两个抗原结合位点具有不同的特异性，可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇，即结构上双价、功能上单价。它实际是一种杂交分子，两条H链之间与两条L链之间的结构不同，两条Fab片段也不同。

1．肿瘤诊断：Krawajew等将制备的抗HRP／抗AFP双特异抗体用双位点结合测定血清中AFP。Gyor~等制备出抗CEA／抗B，半乳糖苷酶双特异抗体，并建立均相酶免疫试验，定量测定CEA。

2．细胞因子的测定：Berkova等制备了抗人肿瘤坏死因子(hTNF)／抗HRP的双特异抗体，以抗hTNF单克隆抗体为

固相包被捕获抗原，用双特异抗体作为二抗，加入底物显色，检测限为1ng／ml。Kontsekova等制备出抗HRP／抗IFNa2的BsMAb，建立了双抗夹心ELISA法，可以检测出0．1ng／ml含量的人 -IFN。Tada等制备出抗人淋巴毒素／抗HRPBsMAb，用一步夹心酶免疫试验检测，其灵敏度与用HRP标记的ELISA几乎一致，它避免了制作标记抗体造成的本底高的弊端，操作简单，不失灵敏性，重复性好。

3．免疫试验通用试剂：Kenigsberg等制备了抗HRP／抗兔IgG双特异抗体，识别IgG分子的Kappa轻链，不与重链结合。用二步法免疫细胞化学定位兔脊三叉神经核表层纤维的降钙素基因相关肽(CGRP)；定位兔原代中隔细胞培养的纤维性神经胶质酸蛋白(GFAP)的免疫活性位点的定位。还可与抗CGRP抗体一起用竞争性ELISA法定量检测CGRP，敏感度可达190 Pg或50 fmolCGRP／~L。此双特异性抗体可用作免疫检测中的通用试剂。Stratieva等制备了抗IL-2／抗HRP双特异抗体，建立直接法EIA和竞争固相EIA。两种方法的敏感度都可达1．5～4ng／ml。

4．在免疫诊断学上的应用：Kontermannn等设计的双特异抗体，一条臂可与抗原蛋清溶菌酶(HEL)、癌胚抗原(CEA)、HIV一1GP120结合，另一条臂为抗大肠杆菌半乳糖苷酶。以该双链抗体作为酶结合物，用ELISA法检测HEL，免疫组化法检测CEA，免疫印迹法检测GP120，加人特异抗体后，再加人B半乳糖苷酶，洗涤后加人底物显色，结果表明，这些方法可检出相应的抗原，证明双特异抗体可用于酶免疫分析。Atwell等制备的双特异抗体，一条臂抗红细胞表面血型糖蛋白的，另一条臂抗神经氨酸酶，中间用一段5个氨基酸(Gly4Set)的接头连接。这段接头的作用是阻止VH、VL结合于一个分子，并稳定二聚体的形态。该抗体可与上述抗原结合，以此建立快速的全血凝集试验。许静等构建了抗白血病Kgla／抗碱性磷酸酶的双特异性抗体，取代了常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测。

    传统的单克隆抗体已广泛应用于II临床及实验室诊断，是免疫检测的基础；基因工程抗体具有独特的优势，对它的研究及应用不断深入，已有部分基因工程抗体用于临床疾病的治疗。单链抗体及双特异抗体在实验室诊断方面具有良好的应用前景，由于它们种种原因，并未将其用于临床应用，但它们具有潜在的优势，基因工程抗体技术的普及将使它们得到广阔的发展空间。

摘自 中华检验医学杂志